我国鼬獾狂犬病病毒分子流行病学研究

【摘要】鼬獾（Melogalemoschata）是一种广泛分布于我国华东、华南等地的小型鼬科动物，我国关于鼬獾狂犬病的首次报道，可追溯到上世纪90年代初。此后，在浙江、江西、安徽等地，均有因鼬獾咬伤导致狂犬病发病死亡的病例发生，当时的狂犬病诊断均根据临床症状和流行病学调查得出，但未进行病原学确诊。鼬獾频繁引起人感染狂犬病的现象表明，鼬獾可能是除犬外，又一重要的狂犬病贮存宿主和传播宿主，并严重危害这些地区的公共卫生安全。国内以前关于野生动物狂犬病流行病学方面的研究缺乏，对于鼬獾狂犬病的研究更不系统，这些地区鼬獾种群内是否存在狂犬病病毒流行，流行毒株与我国现有和历史流行毒株关系，以及其可能来源等问题，都需要通过系统的流行病学监测、调查及深入分析研究得以阐明。控制野生动物狂犬病最有效的措施是对其进行口服免疫，目前国内尚无这方面的研究与报道。针对上述问题，开展以下研究：1.鼬獾狂犬病流行病学监测与病毒演化分析。研究内容：①鼬獾脑组织样品的采集与检测。在江西、浙江等地采集不明原因死亡鼬獾脑组织样品，并进行直接免疫荧光法检测。②狂犬病病毒的分离与鉴定。对检测阳性的样品，经乳鼠脑内接种分离病毒。③鼬獾源狂犬病病毒N基因和G基因的扩增及测序。④狂犬病病毒N基因和G基因序列相似性与遗传演化分析；分析整理获得的数据，使用遗传分析软件，对鼬獾源狂犬病病毒序列和我国流行毒株序列进行对比分析，分析鼬獾分离株之间是否存在进化差异，从而确定鼬獾狂犬病在这些地区流行范围和趋势，并分析鼬獾狂犬病与我国犬和人群中流行狂犬病间的关系。⑤鼬獾源狂犬病病毒N基因演化分析。通过对病毒演化时间推算，揭示其可能来源，评价其公共卫生风险，为制定相应狂犬病防控对策提供理论依据。2.鼬獾源狂犬病病毒全基因组测序与分析。研究内容：①全基因组序列扩增及测序。根据N基因（G基因）遗传进化分析结果，选取不同分枝毒株（JX09-17(fb)、JX09-18、JX10-37）进行全基因测序。②全基因组序列分析。将不同分枝毒株的全基因组核苷酸和氨基酸序列进行对比，并与其他流行株和疫苗株进行比对，分析各结构蛋白氨基酸发生突变的位点。3.重组疫苗和弱毒疫苗对鼬獾的口服免疫试验。研究内容：①鼬獾的口服免疫试验。选取重组疫苗（CAV-2-E3Δ-RGP）和弱毒疫苗（SRV9）分别口服免疫20只鼬獾。②免疫前及免疫后14天、21天分别对免疫鼬獾采血，按照荧光抗体病毒中和试验（FAVN）方法，测定狂犬病病毒中和抗体水平。③统计试验结果，分析和评价两种疫苗的免疫效果，并比较是否存在差异。通过以上试验，获得以下结果：1.流行病学调查与演化分析结果显示，通过连续6年监测，共检测鼬獾脑组织样品2932份，阳性91份（平均阳性率3.1%），经MIT分离获得91株狂犬病病毒。进化分析表明，这些毒株形成4个进化分枝（CladeA、CladeB、CladeC、CladeD），对应的病毒样品，来源于不同的地区：CladeA，包括46株病毒，主要分布于浙江千岛湖周围和鄱阳湖以东地区，与我国狂犬病病毒ChinaII进化关系较近，处于同一进化分枝；CladeC，有27株病毒，主要分布于鄱阳湖以西地区，该分枝毒株进化关系相对独立，与我国狂犬病病毒ChinaI和ChinaII的进化关系均较远；CladeB，8株病毒，分布在江西省抚州地区，与我国狂犬病病毒ChinaI内的犬源分离株核苷酸相似性较高，进化关系较近；CladeD，10株病毒，该分枝内还包括1株浙江省犬源狂犬病病毒，分布于浙江省台州地区，与CladeB鼬獾分离株进化关系较近，同属我国狂犬病病毒ChinaI，而与CladeA和C鼬獾分离株相似性分别为88%和94%左右。通过病毒演化分析，推测出4个分枝毒株分化时间分别为：CladeA~1941年，CladeB~1990年，CladeC~1937年，CladeD~1997年，从分化时间的早晚及分离毒株的数量可以看出，分化越早的病毒分枝，其毒株的数量越多。2.病毒全基因组测序分析结果显示，鼬獾分离株（JX10-37株、JX09-17(fb)株和JX09-18株）与国内流行毒株和疫苗株经氨基酸比对，分别有53个、23个和25个氨基酸位点发生突变，这其中有些位点是发生在狂犬病病毒属内的独特突变（分别为27个、14个和6个）。JX09-17(fb)株在决定病毒毒力的重要基因位点（G蛋白抗原位点III的333位）发生由精氨酸（R）到谷氨酰胺（Q）的突变。JX10-37株在较保守的G蛋白抗原位点I的231位，发生由亮氨酸（L）到丝氨酸（S）的突变。3.对捕获后人工饲养的40只鼬獾的口服免疫结果显示，免疫后21天，FAVN所测免疫动物的中和抗体均发生阳转（0.1–4.5IU/mL），重组疫苗组和弱毒疫苗组分别有17只（17/20）和16只（16/20）鼬獾，中和抗体高于0.50IU/mL，达到临界保护水平。通过以上结果，得出以下结论：1.江西、浙江等地鼬獾种群内，存在狂犬病的独立传播循环；至少有4种不同毒株在流行，呈明显的地域分布；这4个分枝的病毒在不同时期由犬溢出感染鼬獾，并在鼬獾种群内流行；此外，有证据表明，鼬獾与犬可能发生交叉传播。2.通过对3个不同演化分枝的鼬獾分离株全基因序列分析，进一步发现了毒株中与毒力相关基因和演化相关基因的突变；氨基酸位点突变的多样与复杂，说明RABV在鼬獾种群内流行过程中，逐渐向更适应动物的方向发展，同时也说明鼬獾可能对狂犬病高度易感。3.通过对鼬獾的口服免疫试验，证明CAV-2-E3Δ-RGP和SRV9对鼬獾具有良好的免疫效果，免疫3周后有效抗体阳转率分别为85%和80%，说明两种疫苗株均可作为鼬獾口服免疫的候选株。论文创新点：1.本研究首次对我国野生动物鼬獾狂犬病进行系统的流行病学监测与分析，揭示了我国鼬獾狂犬病流行特征以及鼬獾源分离株与犬源和人源狂犬病流行株的演化关系。2.首次发现不同演化分枝鼬獾RABV流行株存在毒力相关基因和演化相关基因的重要突变，明确狂犬病病毒在鼬獾中适应的分子基础。3.首次完成了鼬獾的狂犬病口服免疫试验，明确了我国现有疫苗株对鼬獾的使用效果，为通过口服免疫控制鼬獾狂犬病奠定基础。
【作者】赵敬慧；
【导师】扈荣良；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，预防兽医学，2014，博士
【关键词】狂犬病病毒；鼬獾；分子流行病学；遗传演化分析；口服免疫；

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